文/王新本 贾孝荣 郑金发 徐贵静 杨全龙
摘要：免疫力作为最基本的屏障具有重要意义，主要体现在对内维持体内环境稳定，对外抵抗细菌、病毒等病原体入侵。免疫力低下，会致机体识别和排除“异己”能力不足而呈现不抵抗状态。近年，由于多重因素导致的免疫性疾病越来越多，西药不能起到预防作用，治疗效果不甚明显且存在毒副作用。而中医擅治未病，还讲究阴阳平衡预期，众多天然药物对各种疾病能起到关键作用，尤其在增强免疫、调和气血、维护生理健康等方面效果显著。问美茯苓人参胶囊系国家发明专利配方，源自于敦煌医学、藏医藏药、蒙医蒙药等，是以茯苓、沙棘、人参、蝙蝠蛾拟青霉菌粉为主制成的胶囊剂，本研究依据《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版），研究了问美茯苓人参胶囊在增强小鼠免疫力方面的功效，旨在为免疫力低下及亚健康者提供优选方案。 方法 分别以人体推荐量的10倍、20倍、30倍剂量，即400 mg/kg·BW、800 mg/kg·BW、1200 mg/kg·BW剂量经口给予小鼠30d，测定小鼠体重、脏器/体重比值、细胞免疫、体液免疫、单核-巨噬细胞吞噬功能以及自然杀伤(NK)细胞活性。结果 与对照组相比，各剂量组能显著提高小鼠NK细胞活性、抗体生成细胞数(P＜0.05)；但各剂量对小鼠体重增长、脏器/体重比值、半数溶血值、迟发型变态反应能力、单核－巨噬细胞碳廓清能力、淋巴细胞转化能力及巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力均无显著影响(P＞0.05)。结论 问美茯苓人参胶囊具有显著增强免疫力的功能。
关键词：问美茯苓人参胶囊；细胞免疫；体液免疫；单核-巨噬细胞吞噬功能；NK 细胞活性
免疫力作为最基本的屏障具有重要意义，主要体现在对内维持内环境稳定，对外抵抗细菌、病毒等病原体入侵[1]。免疫力低下，会致机体识别和排除“异己”能力不足而呈现不抵抗状态。近年，由于多重因素导致的免疫性疾病越来越多，西药不能起到预防作用，治疗效果不甚明显且存在毒副作用。而中医擅治未病，还讲究阴阳平衡的预期，众多天然药物对各种疾病能起到关键作用，尤其在增强免疫、调和气血、维护生理健康等方面效果显著[2]。已有研究表明，茯苓在多种急性和慢性炎症的不同实验模型中显示抗炎活性[3] ，茯苓多糖具有调节肠道菌群平衡、持续对抗肥胖和改善代谢作用，其抗肿瘤、增强免疫功能效果优异。人参主要成分为皂苷类、糖类、脂溶性成分、氨基酸类、维生素类等物质，具有增强免疫力、改善记忆、提高睡眠质量、抗疲劳、抗肿瘤等功能[4,5]。蝙蝠蛾拟青霉菌粉可改善机体单核-巨噬细胞的吞噬功能，减轻机体细胞免疫功能低下状态；可对抗或恢复肿瘤对化疗药物导致的免疫抑制或免疫损伤；同时其还可抑制器官移植免疫增强状态，并抑制自身免疫性疾病[6]。沙棘总黄酮等生物活性成分对免疫系统多个环节都具有不同程度调节作用，且沙棘醇可通过免疫调节在放射防护中起重要作用[7-10]。
问美茯苓人参胶囊系国家发明专利配方，源自于敦煌医学、藏医藏药、蒙医蒙药等，是以茯苓、沙棘、人参、蝙蝠蛾拟青霉菌粉为主制成的胶囊剂，本研究依据《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版），研究了问美茯苓人参胶囊在增强免疫力功能方面的功效，旨在为免疫力低下及亚健康者提供优选方案。
一 材料和方法
1 材料
1.1 问美茯苓人参胶囊 以茯苓、沙棘、人参、蝙蝠蛾拟青霉菌粉为原料，经称量、混合、装胶囊、抛光、包装等工艺制得，其色泽呈棕褐色，成人年日推荐量为2400mg/60kgBW。
1.2 主要仪器和试剂 100ul微量注射器、二氧化碳培养箱、电于分析天平，723分光光度仪、离心机，手术器械、SRBC，Hank's液、DNFB、SA线冲液、琼脂糖。印度墨汁、Na2CO3、RPMI640等。
2 方法
2.1 试验动物
由成都达硕生物科技有限公司提供的昆明种小鼠160只，全雌，体重18-22g，生产许可证号为SCXK(川)2008-24SPF级；试验动物房为屏障系统，使用许可证号为SYXK(川)2011-043，温度20-25℃，相对湿度40-70%。
2.2 剂量选择
受试物设400 mg/kg.BW、800 ng/kg.BW、1200 mg/kg.BW三个剂量组（分别相当于人体推荐摄入量的10倍、20倍、30倍)，分别量取5g，10g，15g受试物加蒸馏水至250ml混匀、冷藏保存，用完再配，另设蒸馏水阴性对照组，每组40只动物，分为免疫一组、二组、三组、四组，其中一组用于小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验，二组用于NK细胞活性测定及淋巴细胞转化实验：三组用于抗体生成细胞实验，血清溶血素测定和迟发性变态反应实验；四组用于小品碳廓清实验。小鼠按20ml/kg.BW体重一次经口灌胃，至少连续给于30天，每周称一次体重，调整灌胃体积。
2.3试验方法
2.3.1脏器/体重比值 试验结束时称体重后处死动物，取脾脏和胸腺在电子分析天平上称重，并计算脏/体比值。
2.3.2迟发型变态反位（DTH）（足跖增厚法）
给小鼠腹腔注射2%压积SRBC（0.2ml/鼠）致敏4天后，测量左后足跖厚度，然后在测量部位皮下注射20%（v/v）SRBC（20ul/鼠），于注射后24h测量左后足跖厚度，同一部位测量三次，取平均值，以攻击前后足拓厚定差值（足拓肿胀度）来表示DTH的程度。
2.3.3 ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化试验（MTT法）
无菌取脾，在装有无茵Hank’s液平皿中，用镊子将脾磨碎，制成细胞悬液，200目筛过滤，用Hank’s液洗2次，每次离心10min（1000r/min），然后取沉淀悬浮于1mL的完全培养液中，台酚兰染色计数（应在95%以上），将细胞浓度调整为3×106个/ml，然后将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml、一孔加75ul ConA液，另一孔作对照，置5%CO2孵箱37℃培养72h，培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含小牛血清的RPMI640培养液，同时如入MTT（5mg/ml）50ul/孔继续培养4h，培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙醇，使紫色结晶完全溶解，然后分装到96孔培养板，每孔做3个平行孔，用2010型酶标仪，以570nm波长测定光密度值。
2.3.4抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法）
每只小鼠腹腔注射2%压积SRBC0.2ml，将免疫5天半后的小鼠颈椎脱白处死，取出脾脏放在盛有Hank’s液的平皿内，磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心(1000r/min)10min，用Hank’s液洗2遍，最后将细胞悬浮在5 ml RPMI1640培养液中，台酚兰染色计数（应在95%以上），并将细胞浓度调整为5×106个/ml，制成脾细胞悬液。将琼脂糖配制成1%水溶液，水浴煮30min，与等量双倍浓度Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5ml，再向管内加10%（用SA缓冲液配制）压积SRBC 50ul，脾细胞悬液各20ul做两个平行样，迅速混匀后，倾倒于球脂糖薄层玻片上，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1.5h，然后将补体加入到玻片架凹槽内，继续温育1.5h，计数溶血空斑数。补体制备是采集豚鼠血，分离出血清（至少5只豚鼠的混合血清），将1ml压积SRBC加入到5ml豚鼠血清中，4℃冰箱放至30min，经常振荡，离心取上清，分装、-70℃保存。月时以SA援冲液按1:15稀释。
2.3.5血清溶血素测定（血凝法）
每只小鼠腹腔注射2% SRBC 0.2ml免疫，整续灌胃5天后摘除眼球取血于离心管内，放置1小时，剥离，2000r/min离心10min，收集血清，用生理盐水将血清作倍比稀释，每份稀释12孔，将不同稀释度的血清置于血凝板中，每孔100ul，再加入0.5% SRBC悬液100ul，混匀，置湿盒37℃ 3小时后观察结果，记录每孔的凝聚程度，计算抗体积数。
2.3.6小鼠碳廓清试验
于小鼠尾静脉注射用5倍生理盐水稀释的印度墨汁，按0.1ml/10g墨汁注入后立即计时，于注入墨汁后第2、10min分别从内眦静脉丛取血20ul，加到2mlNa2CO3溶液中，以Na2CO3溶液作空白对照、用723分光光度计在600nm处测定光密度值。取血后将小鼠处死，取肝、脾称重，计算吞噬指数。
2.3.7小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验（半体内法）
每只小鼠腹腔注射用NS洗涤3次后的20%鸡红细胞悬液1ml，30min后，项推脱臼处死，将其固定在鼠板上，正中剪开隙型皮肤，经腹腔注入生理盐水2ml，转动鼠板1min：吸出腹腔洗液1ml，平均滴于2张载玻片上，置湿盒37℃ 30min，取出在生理盐水漂洗、晾干、固定，4%Giemsa PBS染色3min，蒸馏水漂洗晾干，镜检。计算吞噬百分率及吞噬指数。
2.3.8 NK细胞活生测定（乳酸脱氢酶LDH测定法）
颈椎脱臼处死动物，取出脾脏，撕碎，过200目网筛后，用Hank s液洗3次，每次1000r/min离心10min，取细胞浆，灭菌水裂解红细胞，，台酚兰染色计数（应在95%以上），用完全1640培养液配成2×107个/ml细胞悬液。将各只小鼠的细胞悬液取300ul分置于96孔培养板中，每孔100ul，每孔加靶细胞（YAC-1细胞，4×105个/ml）100ul，同时做靶细胞自然释放孔（靶细胞100ul+培养液100ul）及最大释放孔（靶细胞100ul＋2.5%Triton100ul）各3孔，37℃5%CO2培养4小时，取出1500r/min离心5ml，将各孔上清液100ml置于另一培养板中，每孔再加入100ul基质液，10分种后加1mol/L HCl30ul终止反应，在490nm处测定OD值，计算NK细胞活性率。
2.4试验数据统计
试验数据采用SPSS10.0 for Windows软件包处理。对照组与剂量组的数据经方差齐性检验，方差齐，进行方差分析，如P值小于0.05，则用Dunnett法进行两两比较，若方差不齐，则进行数据转换，仍不齐，改用秩和检验，如P值小于0.05，则用Dunnett’s T3法进行两两比较。
二 试验结果及结论
1 试验结果
1.1 问美茯苓人参胶囊对小鼠体重的影响 由表1-4可见，人参茯苓胶囊免疫一组、免疫二组、免一三组及免疫四组动物的初始体重与阴性对照组比，经方差齐心检验，方差齐（P＞0.05），且方差分析结果（P＞0.05），说明各组动物与阴性对照组之间的初始体重是均衡的。免疫一、二、三、四组各剂量组动物试验中期、末期的体重以及试验期间小鼠体重的增长与阴性对照组比较均无显著性差异（P＞0.05）。
表1 问美茯苓人参胶囊各组小鼠的初始体重
|
剂量（mg/kg.BW） |
免疫一组 |
免疫二组 |
免疫三组 |
免疫三组 |
|
动物数（只） |
体重（g） |
动物数（只） |
体重（g） |
动物数（只） |
体重（g） |
动物数（只） |
体重（g） |
|
0 |
10 |
20.50±1.51 |
10 |
20.20±1.32 |
10 |
20.50±1.27 |
10 |
20.10±1.45 |
|
400 |
10 |
20.40±0.97 |
10 |
20.30±1.34 |
10 |
20.30±1.42 |
10 |
20.30±1.34 |
|
800 |
10 |
20.20±1.14 |
10 |
20.30±1.34 |
10 |
19.80±1.40 |
10 |
20.60±0.97 |
|
1200 |
10 |
20.40±1.17 |
10 |
20.60±1.35 |
10 |
20.30±0.95 |
10 |
20.25±1.25 |
表2 问美茯苓人参胶囊各组小鼠的中期体重
|
剂量（mg/kg.BW） |
免疫一组 |
免疫二组 |
免疫三组 |
免疫三组 |
|
动物数（只） |
体重（g） |
动物数（只） |
体重（g） |
动物数（只） |
体重（g） |
动物数（只） |
体重（g） |
|
0 |
10 |
27.10±1.58 |
10 |
27.60±0.84 |
10 |
28.00±1.89 |
10 |
28.00±1.41 |
|
400 |
10 |
28.20±1.23 |
10 |
28.40±1.17 |
10 |
27.30±2.06 |
10 |
27.90±2.13 |
|
800 |
10 |
28.50±1.84 |
10 |
27.80±1.40 |
10 |
28.20±1.68 |
10 |
27.80±1.32 |
|
1200 |
10 |
28.20±1.47 |
10 |
28.50±1.08 |
10 |
27.80±1.23 |
10 |
27.50±2.46 |
表3 问美茯苓人参胶囊各组小鼠的结束体重
|
剂量（mg/kg.BW） |
免疫一组 |
免疫二组 |
免疫三组 |
免疫三组 |
|
动物数（只） |
体重（g） |
动物数（只） |
体重（g） |
动物数（只） |
体重（g） |
动物数（只） |
体重（g） |
|
0 |
10 |
31.40±2.07 |
10 |
31.80±1.48 |
10 |
30.50±2.12 |
10 |
30.90±1.85 |
|
400 |
10 |
30.60±1.70 |
10 |
31.40±1.71 |
10 |
30.60±2.37 |
10 |
30.70±2.00 |
|
800 |
10 |
31.30±2.11 |
10 |
30.80±1.23 |
10 |
30.90±1.52 |
10 |
31.00±1.76 |
|
1200 |
10 |
31.00±1.49 |
10 |
31.70±0.95 |
10 |
31.10±1.91 |
10 |
30.10±2.28 |
表4 问美茯苓人参胶囊对小鼠体重增加的影响
|
剂量（mg/kg.BW） |
免疫一组 |
免疫二组 |
免疫三组 |
免疫三组 |
|
动物数（只） |
体重（g） |
动物数（只） |
体重（g） |
动物数（只） |
体重（g） |
动物数（只） |
体重（g） |
|
0 |
10 |
10.90±0.99 |
10 |
11.60±0.84 |
10 |
10.00±1.70 |
10 |
10.80±1.81 |
|
400 |
10 |
10.20±1.14 |
10 |
11.10±1.60 |
10 |
10.30±2.11 |
10 |
10.40±1.35 |
|
800 |
10 |
11.10±1.37 |
10 |
10.50±1.35 |
10 |
11.10±1.73 |
10 |
10.40±2.01 |
|
1200 |
10 |
10.60±1.71 |
10 |
11.10±1.79 |
10 |
10.80±1.81 |
10 |
10.40±1.60 |
1.2 问美茯苓人参胶囊对小鼠脏器/体重比值的影响
由表5可见，连续灌胃30天后，三个剂量组动物的脾脏/体重比值、胸腺/体重比值与阴性对照组相比，经统计学处理，均无显著性差异（P＞0.05）。
表5 问美茯苓人参胶囊对小鼠脏器/体重比值的影响
|
剂量（mg/kg.BW） |
动物数
（只） |
脾脏/体重 |
胸腺/体重 |
|
（%） |
F值 |
P值 |
（%） |
F值 |
P值 |
|
0 |
10 |
0.44±0.08 |
0.398 |
0.755 |
0.38±0.12 |
0.412 |
0.746 |
|
400 |
10 |
0.45±0.11 |
|
|
0.35±0.06 |
|
|
|
800 |
10 |
0.44±0.06 |
|
|
0.34±0.08 |
|
|
|
1200 |
10 |
0.47±0.07 |
|
|
0.35±0.09 |
|
|
1.3 问美茯苓人参胶囊对小鼠免疫功能的影响
1.3.1问美茯苓人参胶囊对小鼠迟发型变态反应（DHT）的影响
由表6可见，连续灌胃30天后，三个剂量组动物的足跖肿胀度与阴性对照组相比，经统计学处理，均无显著性差异（P＞0.05）。
表6 问美茯苓人参胶囊对小鼠迟发型变态反应（DHT）的影响
|
剂量（mg/kg.BW） |
动物数
（只） |
足跖肿胀度
（mm） |
F值 |
P值 |
|
0 |
10 |
0.74±0.44 |
0.490 |
0.692 |
|
400 |
10 |
0.94±0.18 |
|
|
|
800 |
10 |
0.90±0.31 |
|
|
|
1200 |
10 |
0.78±0.20 |
|
|
1.3.2 问美茯苓人参胶囊对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化试验的影响
由表7可见，连续灌胃小鼠30天后，三个剂量组动物的淋巴细胞增殖能力与阴性对照组相比，经统计学处理，无显著性差异（P＞0.05）。问美茯苓人参胶囊对小鼠细胞免疫试验结果阴性。
表7 问美茯苓人参胶囊对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化试验的影响
|
剂量（mg/kg.BW） |
动物数
（只） |
淋巴细胞增殖能力
（OD差值） |
F值 |
P值 |
|
0 |
10 |
0.100±0.037 |
1.481 |
0.236 |
|
400 |
10 |
0.131±0.049 |
|
|
|
800 |
10 |
0.112±0.046 |
|
|
|
1200 |
10 |
0.135±0.037 |
|
|
1.4 问美茯苓人参胶囊对小鼠体液免疫的影响
1.4.1 问美茯苓人参胶囊对小鼠抗体生成细胞的影响
由表8可见，连续灌胃30天后，三个剂量组动物的溶血空斑数与阴性对照组相比，经统计学处理无显著性差异（P＞0.05）。
表8 问美茯苓人参胶囊对小鼠抗体生成细胞的影响
|
剂量（mg/kg.BW） |
动物数
（只） |
溶血空斑数/106脾细胞 |
F值 |
P值 |
|
0 |
10 |
489.0±87.9 |
2.257 |
0.098 |
|
400 |
10 |
584.0±87.0 |
|
|
|
800 |
10 |
556.0±90.1 |
|
|
|
1200 |
10 |
574.0±94.8 |
|
|
1.4.2 问美茯苓人参胶囊对小鼠血清溶血素的影响
由表9可见，连续灌胃30天后，三个剂量组动物的抗体积数与阴性对照组相比，经统计学处理，有显著性差异（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01）。人参茯苓胶囊对小鼠细胞免疫试验结果阳性。
表9 问美茯苓人参胶囊对小鼠血清溶血素的影响
|
剂量（mg/kg.BW） |
动物数
（只） |
抗体积数 |
F值 |
P值 |
|
0 |
10 |
92.30±11.41 |
7.566 |
|
|
400 |
10 |
115.50±20.53 |
|
0.010 |
|
800 |
10 |
120.30±21.90 |
|
0.002 |
|
1200 |
10 |
125.20±9.47 |
|
0.000 |
1.5 问美茯苓人参胶囊对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响
1.5.1 问美茯苓人参胶囊对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清功能的影响
由表10可见，连续灌胃30天后，三个剂量组动物的碳廓清能力与阴性对照组相比，经统计学处理无显著性差异（P＞0.05）。
表10 问美茯苓人参胶囊对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清功能的影响
|
剂量（mg/kg.BW） |
动物数
（只） |
巨噬指数
（a） |
F值 |
P值 |
|
0 |
10 |
6.22±0.50 |
1.967 |
0.136 |
|
400 |
10 |
5.65±0.89 |
|
|
|
800 |
10 |
5.53±0.84 |
|
|
|
1200 |
10 |
5.42±0.87 |
|
|
1.5.2 问美茯苓人参胶囊对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响
由表11可见，连续灌胃30天后，三个剂量组动物的吞噬率和吞噬指数与阴性对照组相比，经统计学处理无显著性差异（P＞0.05）。问美茯苓人参胶囊对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能试验结果阴性。
表11 问美茯苓人参胶囊对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响
|
剂量（mg/kg.BW） |
动物数
（只） |
吞噬率
（%） |
F值 |
P值 |
吞噬指数 |
F值 |
P值 |
|
0 |
10 |
25.20±2.28 |
2.074 |
0.121 |
1.20±0.74 |
0.787 |
0.509 |
|
400 |
10 |
26.05±2.51 |
|
|
1.22±0.65 |
|
|
|
800 |
10 |
26.95±3.03 |
|
|
1.23±0.66 |
|
|
|
1200 |
10 |
27.87±2.12 |
|
|
1.24±0.51 |
|
|
1.6 问美茯苓人参胶囊对小鼠NK细胞活性的影响
由表12可见，连续灌胃30天后，三个剂量组动物NK细胞活性与阴性对照组相比，经统计学处理，低、中剂量组有显著性差异（P＜0.05、P＜0.01）。问美茯苓人参胶囊对小鼠NK细胞活性试验结果阳性。
表12 问美茯苓人参胶囊对小鼠NK细胞活性的影响
|
剂量（mg/kg.BW） |
动物数
（只） |
NK细胞活性
（%） |
F值 |
P值 |
|
0 |
10 |
40.18±6.77 |
4.994 |
|
|
400 |
10 |
48.60±8.13 |
|
0.013 |
|
800 |
10 |
49.74±4.40 |
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0.004 |
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1200 |
10 |
43.98±4.90 |
|
0.395 |
2 结论与讨论
问美茯苓人参胶囊源自于敦煌医学S.2438卷子“服茯苓饼方”与《外台》卷十引《救急方》“茯苓人参散”，原配方均具有“补养气血、平衡代谢......延年益寿”之功能，通过进一步研究藏医藏药冬虫夏草、蒙医蒙药沙棘，结合现代医学理论，创新出兼具中藏蒙药为一体的全新增强免疫保健食品功能配方。经过小鼠功能试验30天后，该配方对小鼠的体液免疫试验结果阳性；对小鼠NK细胞活性试验结果阳性。由此可见：问美茯苓人参胶囊具有显著的增强免疫力功能。另外，通过多年应运发现问美茯苓人参胶囊不局限于免疫功能的提高，其组方对睡眠障碍、肥胖症、脱发白发，防癌抗癌，调理女性气血失调、月经不调，维护生理健康等方面效果依然卓越。
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